文章轉載自：中國醫學文摘·皮膚科學2017年第3期

作者：張燕，呂國彥，王濤，劉桂麗，李瑞靜，高順強

敏感性皮膚是一種對外界刺激呈過度反應的特殊皮膚類型，臨床表現多樣，紅斑常見，并伴有不同程度的主觀不適。紅斑的病理表現是真皮乳頭層毛細血管網擴張而產生的紅色斑疹。血管內皮生長因子( vascular endothelial growth factor，VEGF) 具有促進血管新生及擴張等作用，在多種組織和疾病中表達。在表皮，VEGF 主要由角質形成細胞分泌。筆者考慮如果能減少 VEGF 的分泌或有效抑制其作用，將會達到改善皮膚泛紅的功效。木天蓼 ( actinidia polygama，AP) 即葛棗獼猴桃，屬獼猴桃科植物，主要分布于亞洲國家，其枝葉、果實均可入藥。據研究，木天蓼中含有生物堿、木天蓼內酯、B-苯乙醇等多種成分，特別是其中的 α-亞麻酸具有抗炎作用，尤其是可以使浮腫明顯減輕。本研究著眼于紅斑這一敏感性肌膚的典型表現，定位于與血管擴張密切相關的 VEGF，通過體外細胞培養的方法，探討木天蓼改善皮膚紅斑的作用機制，為研發緩解皮膚泛紅的新型植物護膚品提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 材料及試劑 人表皮角質形成細胞 ( HEK) 為Cascade Biologics 公司產品，購自北京清源浩生物科技有限公司。胰蛋白酶/EDTA 溶液、胰蛋白酶抑制劑、Eplife 培養基、HKGS 添加劑、青霉素、氯霉素雙抗購自美國 GIBCO 公司；VEGF ELISA 試劑盒為 Ｒ＆D Sys-tems 公司產品; 二甲基亞砜( DMSO) 購自北京化工廠。其他試劑: 如十二水磷酸氫二鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀等試劑均為國產分析純等級。

1. 2 主要儀器 多功能酶標儀 ( Synergy II ) 為美國Biotek 公司產品; 臺式離心機為德國 Heraeus 公司產品; CO2恒溫培養箱為美國 Sheldon 公司產品; 超凈工作臺為北京凈化設備有限公司產品; 37℃ 恒溫水浴箱為溫州醫療器械廠產品; 倒置顯微鏡為日本 Nikon 公司產品。

1. 3 木天蓼提取物的制備

1. 3. 1 木天蓼水溶性提取物( APW) 的制備

取木天蓼生藥材 100g 粉碎后浸泡于 1 000m L 雙蒸水中，室溫過夜，水浴回流提取 2 次，每次 1h，將上清液合并，用2% 活性炭 80℃ 蒸煮 脫色 30min，8 000r / min 離 心10min，取上清液用旋轉冷凍蒸發器蒸發干燥，所得粉劑為木天蓼水提取物。4℃保存，使用時用完全培養基稀釋成終濃度。

1. 3. 2 木天蓼醇溶性提取物( APE) 制備

取木天蓼生藥材 100g 粉碎后放入三角燒瓶中，加入 10 倍體積的 70% 乙醇，室溫密閉浸泡 7d，期間每隔 2 ～ 3d 搖晃燒瓶，6 ～ 8 層紗布過濾祛除渣滓，加入 2% 活性炭80℃ 蒸煮脫色，旋轉冷凍蒸發器減壓蒸發成粉狀物，所得干粉為木天蓼醇提取物。使用時首先用二甲基亞砜( DMSO) 稀釋成 200mg /m L 的濃縮液，然后用完全培養基稀釋成終濃度。

1. 4 細胞培養

配制 HEK 的完全培養基，并加入100U / L 青霉素和 100mg / L 鏈霉素。將 HEK 于 37℃ ，5% CO2細胞培養箱內用完全培養基培養，適時傳代備實驗用。實驗選用 96 孔細胞培養板，取對數生長期細胞用于實驗。將細胞消化后制成細胞懸液，濃度為每孔 3 200 個細胞/200μL 培養基，37℃，5% CO2細胞培養箱內培養，備用于以下實驗。

1. 5 木天蓼提取物工作液的配制

將 APW 和 APE分 別 用 完 全 培 養 基 稀 釋 為 25μg /m L，50μg /m L，100μg / m L，200μg / m L 濃度。設置陰性對照組 ( 無細胞、無刺激液，僅加完全培養基) 、陽性對照組( 有細胞、用 PBS 替代刺激液，加完全培養基) 、基質對照組( 有細胞、無刺激液，有含 1% DMSO 的完全培養基) 。

1. 6 MTT 法測定木天蓼提取液對 HEK 增殖活力的影響

取對數生長期 96 孔板( 1. 4 來源) 應用于以下實驗。棄去舊培養基，將不同濃度的刺激液分別加入96 孔板，放入培養箱中孵育。24h 后終止細胞培養。吸去每孔內的上清液( 保存備測 VEGF 濃度) ，加入10% MTT( MTT ∶ 完全培養基 = 1 ∶ 9 ) 100μL / 孔，37℃ ，5% CO2培養箱培養 2h。酶聯免疫檢測儀器490nm 及690nm 分別讀數，評估 HEK 增殖活力是否受木天蓼工作液影響。

1. 7 ELISA 法測定木天蓼提取物對 HEK 分泌 VEGF的影響

嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1. 7. 1 不同濃度及種類不同基質的木天蓼提取液對HEK 分泌 VEGF 的影響

加入各種培養基培養 24h后，測定回收的細胞培養基( 1. 6 來源) 中 VEGF 的濃度，并繪制 VEGF 濃度曲線。

1. 7. 2 不同時間內最佳濃度的 APE 對角質形成細胞分泌 VEGF 的影響

選取最佳種類及濃度的木天蓼刺激液( 根據 1. 7. 1 測定結果而定) ，對 96 孔板( 1. 4 來源) 培養的細胞進行刺激實驗，分別在 12h，24h，36h收集培養液，測定 VEGF 該時間段的產生量，和對照組相比，計算出VEGF 產生的相對被抑制率，并繪制時間相關曲線。

1. 8 統計學處理

用 SPSS13. 0 軟件，數據表示用均數 ± 標準差( x ± s) ，正態分布的多個均數的比較使用析因設計的方差分析( ANOVA) ，不同時間點上均數的比較采用重復測量( repeated measure) 的方差分析，對不滿足正態和方差齊性條件的樣本量偏小的計量資料，采用 LSD 方法，P ＜ 0. 05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2. 1 MTT 法測定木天蓼提取液對 HEK 增殖活力的影響 見表 1。不同濃度的 APW 和 APE 對 HEK 的增殖活性無明顯影響，與對照組相比差異均無統計學意義( F = 0. 973，P = 0. 44) 。

2. 2 木天蓼提取液對 HEK 分泌 VEGF 的影響 見表2，圖 1。 在 刺 激 物 濃 度 為 50μg / m L，100μg / m L，200μg / m L時，APE 與 APW 相比，對 VEGF 分泌的抑制能力強，差異具有統計學意義( P = 0. 02) ; 與對照組相比差異亦有統計學意義( P ＜ 0. 01) ; APE 對 HEK 分泌VEGF 的抑制作用具有濃度依賴性。

2. 3 不同時間最佳濃度的 APE 對 HEK 分泌 VEGF的影響

見表 3 ～ 4，圖 2。應用 100μg /m L APE 刺激HEK，測定并計算不同時間段 APE 對 HEK 分泌 VEGF的抑制率，不同時間點上均數的比較采用重復測量( repeated measure) 的方差分析，結果顯示 APE 對 HEK分泌 VEGF 的抑制具有時間依賴性; 各時間點細胞增殖活力差異無統計學意義( F = 0. 019，P= 0. 90) 。

3 討論

敏感性皮膚皮膚科常見，易出現紅斑、丘疹、脫屑、毛細血管擴張等客觀癥狀。患者常主訴皮膚泛紅，燒灼感。皮膚泛紅即毛細血管擴張，是皮膚的毛細血管因某種原因持續性擴張而造成的。短時間內的血管擴張可產生一過性的泛紅，長期擴張則會產生局部或廣泛的紅斑。長時間擴張，毛細血管會日漸失去彈性和韌性，越來越難以恢復; 皮膚也會日益敏感脆弱，并加速色斑、皺紋、松弛等老化跡象的產生，嚴重影響美觀。VEGF 是一種非常重要的細胞因子，在表皮主要由角質形成細胞( keratinocyte，KC) 分泌，具有促使血擴張

、增加血管通透性( 作用較組胺強50 000 倍) 等多種生物學作用。其共有 8 種亞型，不同亞型的生物學特性不同，從而導致出現不同的臨床表現、病程及預后。如: VEGF165 高表達的黑素瘤細胞，血管增殖明顯;而 VEGF121 高表達的黑素瘤則很少形成血管，易發生缺血壞死。就形態學而言，血管擴張的過程中不可避免的發生了血管內皮細胞形態及細胞間連接的變化。與其他亞型相比，VEGF121 促血管擴張及通透性增加的作用更強，且很可能是造成皮膚紅斑的主要原因。因此筆者考慮如果能減少 VEGF 的分泌或有效抑制其作用，有望達到改善皮膚泛紅的功效。木天蓼 ( actinidia polygama，AP) 屬獼猴桃科植物，落葉藤本，主要分布于亞洲國家，其枝、葉、果實均可入藥。早在 2003 年韓國學者通過動物模型及體內外試驗證明，木天蓼果實的乙醇提取物能夠明顯抑制乙酸誘導的血管通透性增加，并且呈劑量依賴性，水溶液提取物能明顯抑制角叉藻聚糖誘導的小鼠足部的水腫反應。本實驗通過 HEK 體外培養技術，采用 MTT 法及ELISA 法檢測 AP 提取物對 HEK 的影響。結果發現，與對照組相比，APW 和 APE 對 HEK 分泌 VEGF 均有抑制作用，但APE 的抑制作用更強，且有濃度和時間依賴性。并且發現，即使濃度達到 200μg/m L，木天蓼提取液對 HEK 增殖活力亦無明顯影響，因此筆者認為培養基中 VEGF 含量的減少并不是因為細胞數量減少而引起。通過以上結果筆者推斷，木天蓼提取液可通過抑制 HEK 分泌VEGF 來減輕血管擴張及通透性增高，從而在一定程度上起到改善皮膚紅斑的作用。并且從藥物安全角度出發，木天蓼對 HEK 的增殖活性無明顯抑制作用。

目前，隨著護膚理念由單純保濕向追求皮膚健康的轉變，植物成分的醫學護膚品以其療效穩定，刺激性小以及安全性高的優勢，已經成為當今時尚追求和高端美容的體現。希望今后的研究能以此實驗結果為契機，研發出木天蓼提取物為主要成分的醫學護膚品，用來改善 VEGF 引起的皮膚泛紅。

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