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文章轉(zhuǎn)載自：中國(guó)醫(yī)學(xué)文摘·皮膚科學(xué)

作者：加楊娥，任立汆，燕華玲，冶娟，王永，郭硯，哈筱梅，朱世文，王剛

人體的衰老與紫外線有著直接的關(guān)系。能到達(dá)地面的紫外線主要是UVA(占95% )和UVB(占5% )，但同等劑量的條件下，UVB輻射損傷比UVA大800～1 000倍，同時(shí)UVB輻射還具有遺傳毒性。由此可見(jiàn)，對(duì)人體損傷最大的紫外線是UVB。黑枸杞富含豐富的多糖、花色苷、原花青素、酚酸和黃酮等活性成分，具有較強(qiáng)的抗氧化、抗衰老活性。本實(shí)驗(yàn)以Ha Ca T細(xì)胞為研究對(duì)象，建立UVB損傷模型，以黑枸杞水提物作為干預(yù)因素，旨在探討黑枸杞水提物在UVB損傷Ha Ca T細(xì)胞模型中的抗氧化作用。

1材料與方法

1. 1材料

黑果枸杞購(gòu)自青海德令哈市壹葉香茶行;Ha Ca T細(xì)胞株購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;DMEM培養(yǎng)基和FBS購(gòu)自GIBCO公司; MTS購(gòu)自Pro-mega試劑公司; SOD，GSH-Px，CAT，MDA試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所;二氧化碳( CO2)培養(yǎng)箱購(gòu)自上海力申科學(xué)儀器有限公司; IX71型Olympus倒置顯微 鏡 購(gòu) 自Olympus;飛 利 浦TL20W/12紫 外 線UVB燈管購(gòu)自上海杰圖商貿(mào)有限公司。

1. 2黑枸杞水提物的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取黑枸杞干果100g，加入蒸餾水500m L，煮沸2h，過(guò)濾，濾渣中加入同樣的蒸餾水繼續(xù)煮沸，重復(fù)3次，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，冷凍干燥獲得黑枸杞水提物粉末。

1. 3細(xì)胞培養(yǎng)

向裝有Ha Ca T細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中加入含有10%胎牛血清和1%的雙抗(鏈霉素和青霉素)的DMEM培養(yǎng)基，于37℃，5% CO2的飽和濕度條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)80%～90%融合時(shí)，進(jìn)行傳代，PBS液沖洗培養(yǎng)瓶底3遍，加入胰酶1. 5m L于培養(yǎng)箱中消化3min，當(dāng)細(xì)胞變圓、間隙變大時(shí)，加入4～5倍的含FBS的DMEM培養(yǎng)基終止細(xì)胞消化，收集細(xì)胞懸液離心，按1∶3比例傳代，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期3～5代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1. 4實(shí)驗(yàn)分組及處理.

1. 4. 1實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分五組，分別為空白對(duì)照組、UVB照射組( UVB 30m J / cm2輻射40min)、UVB +低劑量黑枸杞水提物組( UVB 30m J/cm2輻射40min +黑枸杞水提物0. 5mg/m L)、UVB +中劑量黑枸杞水提物組( UVB 30m J/cm2輻射40min +黑枸杞水提物1mg/m L)、UVB +高劑量黑枸杞水提物組( UVB 30m J / cm2輻射40min +黑枸杞水提物2mg / m L )。 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Ha Ca T細(xì)胞，胰酶消化3min，當(dāng)細(xì)胞變圓、間隙變大時(shí)，加入4～5倍的含FBS的DMEM培養(yǎng)基終止細(xì)胞消化，將其吹打?yàn)榧?xì)胞 懸 液，調(diào)整 細(xì) 胞 濃 度 為105個(gè)/m L和4×105個(gè)/m L，分別接種于96孔板和6孔板中(前者用于MTS實(shí)驗(yàn)，后者用于SOD，CAT，GSH-Px，MDA測(cè)定)。黑枸杞水提物組于UVB照射前12h加入，空白對(duì)照組和UVB模型組只加入相同量的培養(yǎng)基。各組于UVB照射前棄去培養(yǎng)基，加入 少 量的PBS，防止細(xì)胞干燥。空白組用錫箔紙遮蔽。將96孔板和6孔板置于UVB燈管的正下方，距離20cm，強(qiáng)度30m J / cm2，輻 照 時(shí) 間 為40min。照 射 結(jié) 束 后，吸 去PBS，加入新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)20h。

1. 4. 2倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化

按上述操作完成后，于倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化及死亡情況。

1. 4. 3 MTS比色法測(cè)細(xì)胞增殖活力

按上述方法處理細(xì)胞后，MTS法測(cè)細(xì)胞增殖活力。每孔中加入20μLMTS，培養(yǎng)箱中孵育3h后，酶標(biāo)儀測(cè)出各孔在490nm處的吸光度。

1. 4. 4酶生化法測(cè)定細(xì)胞

SOD活力、GSH-Px含量、CAT活力及MDA含量 按上述方法處理細(xì)胞后嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)檢測(cè)SOD活力、GSH-Px含量、CAT活力及MDA含量。

1. 5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS19. 0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以( x±s)表示，滿(mǎn)足正態(tài)分布或方差齊性檢驗(yàn)，組間比較用單因素方差分析;否則進(jìn)行秩和檢驗(yàn)。多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2. 1倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞變化 見(jiàn)圖1。UVB照射40min

后，細(xì)胞形態(tài)模糊不清，并出現(xiàn)細(xì)胞死亡成碎片及脫片現(xiàn)象;低劑量水提物組部分細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞脫片現(xiàn)象稍有減少，中劑量和高劑量水提物組細(xì)胞形態(tài)基本正常，細(xì)胞脫片現(xiàn)象明顯減少。

2. 2 MTS比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力 見(jiàn)表1。UVB照射組A值較空白對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0. 05) ; UVB +低劑量水提物組、UVB +中劑量水提物組、UVB +高劑量水提物組A值較UVB照射組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0. 05) ; UVB +低劑量水提物組、UVB +中劑量水提物組、UVB +高劑量水提物組相互之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0. 05)。2. 3 SOD活力、GSH-Px含量、CAT活力、MDA含量檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表1。UVB照射組SOD活力、GSH-Px含量、CAT活力較空白對(duì)照組降低，MDA含量較空白對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0. 05) ; UVB +低劑量水提物組CAT活力較UVB照射組降低、MDA含量較UVB照射組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0. 05) ;UVB +中劑量水提物組和UVB +高劑量水提物組SOD活力、GSH-Px含量、CAT活力較UVB照射組升高，MDA含量較UVB照射組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0. 05) ; UVB +高劑量水提物組SOD活力、GSH-Px含量、CAT活力較UVB +中劑量水提物組升高，MDA含量較UVB +中劑量水提物組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0. 05)。

3討論

在《新編藏醫(yī)學(xué)》《晶珠本草》《維吾爾藥志》等醫(yī)學(xué)書(shū)籍中都有記載黑果枸杞可治療心熱病、心臟病、月經(jīng)不調(diào)等疾病，且效果顯著。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實(shí)黑果枸杞含有多種有效成分，包括原花青素、多糖、酚酸、黃酮等成分，具有防癌、提高免疫力、抗氧化、抗衰老、緩解眼睛疲勞等多種功能，是一種安全無(wú)毒的“藥食兩用”的資源。正常細(xì)胞有較為穩(wěn)定的氧化/抗氧化系統(tǒng)，SOD是生物體內(nèi)最重要的自由基清除劑，其活性高低則反映了機(jī)體清除氧自由基的能力。CAT和GSH-Px可清除脂類(lèi)氫過(guò)氧化物和H2O2，使細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能免受過(guò)氧化物的損傷。當(dāng)紫外線照射過(guò)量時(shí)，可通過(guò)損傷DNA和生成過(guò)多的 ＲOS間接損傷核酸、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)從而引起光老化、皮膚癌等。ＲOS通過(guò)激活凋亡蛋白和影響各種代謝和酶的活性導(dǎo)致組織損傷。MDA是細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化的終末產(chǎn)物，反映了膜脂質(zhì)過(guò)氧化的程度。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，30m J/cm2的UVB可造成Ha Ca T細(xì)胞形態(tài)模糊不清，細(xì)胞死亡成碎片及脫片現(xiàn)象嚴(yán)重。無(wú)論是低劑量、中劑量、高劑量黑枸杞水提物均可減輕UVB輻射后Ha Ca T細(xì)胞形態(tài)改變及細(xì)胞脫片現(xiàn)象。MTS檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果顯示: UVB +低劑量黑枸杞水提物組、UVB +中劑量黑枸杞水提物組和UVB +高劑量黑枸杞水提物組A值均較UVB照射組升高。說(shuō)明黑枸杞水提物可以促進(jìn)Ha Ca T細(xì)胞在UVB輻射損傷后的增殖。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，UVB可降低SOD活力、GSH-Px含量、CAT活力，升高MDA含量。說(shuō)明UVB可破壞Ha Ca T細(xì)胞的氧化防御系統(tǒng)，使細(xì)胞清除 ＲOS的能力減弱，造成細(xì)胞膜及細(xì)胞器的損傷。而UVB +低劑量水提物組CAT活力較UVB照射組降低、MDA含量較UVB照射組升高，提示低劑量水提物不能抑制UVB對(duì)Ha Ca T細(xì)胞的氧化損傷，可能由于藥物孵育時(shí)間過(guò)短或UVB照射時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，但其具體原因有待于進(jìn)一步研究。中劑量和高劑量水提物均可升高SOD活力、GSH-Px含量、CAT活力，降低MDA含量;且UVB +高劑量水提物組SOD活力、GSH-Px含量、CAT活力較UVB +中劑量水提物組更高，MDA含量較UVB +中劑量水提物組更低，提示中劑量和高劑量水提物均可減輕UVB對(duì)Ha Ca T細(xì)胞的氧化損傷，并在一定的濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴(lài)關(guān)系。

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，低劑量黑枸杞水提物不能對(duì)抗UVB對(duì)Ha Ca T細(xì)胞的氧化損傷，而中劑量和高劑量黑枸杞水提物可減輕UVB對(duì)Ha Ca T細(xì)胞的氧化損傷，并在一定的濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴(lài)關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步探討黑枸杞水提物抑制UVB對(duì)Ha Ca T細(xì)胞氧化損傷作用研究提供了理論依據(jù)。

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