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本文轉(zhuǎn)自《中國(guó)皮膚性病醫(yī)學(xué)雜志2017年01期》

作者張芙蓉，徐宇，劉洋，楊國(guó)玲

頭癬是頭皮及頭發(fā)的淺部真菌感染，在世界范圍流行。近年來(lái)隨著抗生素的濫用、糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑的使用使得頭癬的發(fā)病率逐年上升。大規(guī)模流行病學(xué)資料顯示目前犬小孢子菌成為頭癬的主要致病菌。頭癬主要發(fā)生在兒童，極少部分發(fā)生在成人。這可能與兒童頭皮組織皮脂腺發(fā)育不完全，缺乏抑制犬小孢子菌的功能有關(guān)。因頭癬預(yù)后可引起永久性脫發(fā)及萎縮性瘢痕，嚴(yán)重影響患者的身心健康，而目前頭癬的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，故明確頭癬的致病因子以及發(fā)病機(jī)制意義十分重大。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者一致認(rèn)為頭癬的發(fā)病與蛋白酶有關(guān)。大量研究發(fā)現(xiàn)，此類蛋白酶包括角蛋白酶、彈性蛋白酶、膠原酶、酯酶、神經(jīng)酰胺酶和磷酸酶等，其中角蛋白酶的致病性比較明確，但是否有其他蛋白酶參與頭癬的發(fā)病尚不清楚。故本課題組前期研究了犬小孢子菌在不同組織( 成人頭皮組織、兒童頭皮組織及兒童光滑皮膚組織)誘導(dǎo)下產(chǎn)生的某些蛋白酶導(dǎo)致兒童頭癬的發(fā)生，運(yùn)用抑制消減雜交技術(shù)構(gòu)建了犬小孢子菌差異基因文庫(kù)，從中篩選出與頭皮誘導(dǎo)培養(yǎng)相關(guān)的 4 個(gè)上調(diào)表達(dá)基因，其中一個(gè)與 FSH1 基因高度同源，稱為 FSH1 基因。通過(guò)實(shí)時(shí)定量 PCＲ 技術(shù)得出 FSH1 基因在兒童頭皮組織培養(yǎng)基中較光滑皮膚組織培養(yǎng)基中呈高度上調(diào)表達(dá)，其中上調(diào)倍數(shù) 44. 6。通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究，得出犬小孢子菌頭癬株 FSH1 mＲNA 表達(dá)明顯高于體癬株，經(jīng)兒童頭皮或包皮誘導(dǎo)后犬小孢子菌 FSH1 mＲ-NA 表達(dá)較誘導(dǎo)前明顯升高，再次證實(shí) FSH1 可能與犬小孢子菌的生長(zhǎng)和致病性密切相關(guān)。因此我們猜測(cè) FSH1 可能是犬小孢子菌所致頭癬的致病因子。曾有學(xué)者報(bào)道絲氨酸蛋白酶與犬小孢子菌入侵、黏附動(dòng)物的角質(zhì)細(xì)胞有關(guān)。

為了進(jìn)一步明確 FSH1 的致病作用，本文采用 c DNA末端快速擴(kuò)增( Ｒapid c DNAend amplification，ＲACE) 獲取 FSH1 基因的 c DNA 全長(zhǎng)序列并對(duì)其分析，為進(jìn)一步探索 FSH1 基因在犬小孢子菌所致頭癬中的功能奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 材料

1. 1. 1 菌種來(lái)源

犬小孢子菌標(biāo)準(zhǔn)株( 10394 ) 為大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科真菌室購(gòu)買菌種。

1. 1. 2 試劑

3'-Full ＲACE Core Set with Prime-ScriptTMＲTase、Prime ScriptTMII High Fidelity ＲT-PCＲKit、Tks GflexTMDNA Polymerase、Ta KaＲa Mini BESTAgarose Gel DNA Extraction Kit、5'-Full ＲACE Kit withTAP、DNA Ligation Kit 購(gòu)自日本 Ta KaＲa 公司，T-Vec-tor p MDTM20、克隆載體 p MDl8-T vector，克隆受體菌E. coli Competent Cells JM109 均購(gòu)自寶生物( 大連) 有限公司。

1. 2 方法

1. 2. 1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)前期測(cè)序得到的FSH1 基因片段、5'及 3'擴(kuò)增試劑盒中的引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)引物序列。所需引物見表 1。

1. 2. 2 犬小孢子菌的培養(yǎng)

將犬小孢子菌標(biāo)準(zhǔn)株接種于葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基中27℃ 活化培養(yǎng) 10 天后，接種于葡萄糖瓊脂液體培養(yǎng)基 27℃，150r/min 震蕩 10d，用于提取總 ＲNA。

1. 2. 3 犬小孢子菌總 ＲNA 的提取

參照Trizol 試劑盒說(shuō)明書提取總 ＲNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定 A260/A280( 正常值為 1. 80 ～ 2. 00) ，用 1% 瓊脂糖凝膠電泳對(duì)完整性和有無(wú)降解及基因組污染等分析。

1.2. 4全長(zhǎng)CDNA的克隆

全長(zhǎng)CDNA的克隆分以下幾步完成。

1．2．4．1

3'ＲACE按照3'-FullＲACE Core Set withPrime ScriptＲTase反 轉(zhuǎn) 錄c DNA， 總 ＲNA lμL，3'ＲACE Adaptor( 5μM) lμL，d NTP mix( 10 m M ) lμL，加入無(wú) ＲNA酶的無(wú)菌水至總體積7. 5μL。混勻后65℃ 孵育5 min，迅速置于冰上，短暫離心，然后加入以下組分: 5x Prime SCript Buffer 2μL，Prime SCriptＲTase( 200U/μL ) 0. 25μL，ＲNase Inhibitor ( 40U/μl )0. 25μL，混勻后42℃ 孵育60 min，70℃ 孵育15 min以滅活反轉(zhuǎn)錄酶，置于冰上，即為c DNA第一鏈，用作下一步PCＲ 擴(kuò)增的模板。使用Tks GflexTMDNA Poly-merase進(jìn)行PCＲ 擴(kuò)增。Outer PCＲ 反應(yīng)體系為: c DNA反應(yīng)液1μL，2x Gflex Buffer ( Mg2 +，d NTP plus) 25μL，Tks Gflex DNA Polymerase ( 1. 25μ/μL) 1μL，3’ＲACEOuter Primer( 10μM) 2μL，FSH1-F1-YZ Primer( 20μM)1μL，加無(wú)菌水至總體積20μL。Outer PCＲ 反應(yīng)程序?yàn)?/span>: 94℃1min，( 98℃10s，55℃15s，68℃l min) 30個(gè)循環(huán)。Inner PCＲ 反應(yīng)體系為將c DNA反應(yīng)液換成OuterPCＲ 反應(yīng)液，FSH1-F1-YZ Primer換成FSH1-F1 Primer即可，經(jīng)過(guò)同樣反應(yīng)條件，取5μL PCＲ 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。剩余PCＲ 產(chǎn)物按照Ta KaＲa Mini BESTAgarose Gel DNA Extraction Kit切膠回收目的條帶。

1．2．4．2

5'ＲACE按照Ta KaＲa 5'-FullＲACE Kitwith TAP使用說(shuō)明書進(jìn)行，對(duì)TotalＲNA進(jìn)行CIAP、TAP處理，并與5'ＲACE Adaptor連接后，反轉(zhuǎn)錄合成c DNA。反應(yīng)體系為LigatedＲNA 6μL，Ｒandom 9 mers( 50μM) 0. 5μL，d NTP Mixture (每個(gè)10 m M) 1μL，加入 ＲNase Free d H2O至7. 5μL，70℃10 min，立即在冰上放置2min。再在上述變性、退火后反應(yīng)液加入下列組分: 5* M-MLVBuffer 2μL，ＲNase Inhibitor( 40U /μl)0. 25μL， Ｒeverse Transcriptase M-MLV( 200U /μL) 0. 25μL，反應(yīng)條件:42℃60 min，30℃10 min，70℃15min。將所得的c DNA進(jìn)行PCＲ 擴(kuò)增，條件與3’ＲACE相同，僅引物在Outer PCＲ 反應(yīng)體系中換成5’ＲACEOuter Prime，FSH1-Ｒ1-YZ Prime，在Inner PCＲ 反 應(yīng) 體 系 的 引 物 換 成FSH1-Ｒ1 Prime。 所得的PCＲ 產(chǎn)物用Gel Extraction Kit試 劑 盒 回 收。使 用Ta KaＲa DNA Ligation KitVer.2. 1中的連接酶，將上述PCＲ 產(chǎn)物與T-Vector p MDTM20連接后，熱轉(zhuǎn)化至E．Coli Competent Cells JM109中，涂布平板，37℃ 過(guò)夜培養(yǎng)。挑選陽(yáng)性菌落，提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。

1．2．4．3 ＲACE序列驗(yàn)證

使用Tks Gflex DNA Polymerase進(jìn)行PCＲ擴(kuò)增，PCＲ 反 應(yīng) 體 系 為: 3’ＲACEPCＲ 反 應(yīng) 液1μL，2x Gflex Buffer( Mg2 +，d NTP plus) 25μL，Tks GflexDNA Polymerase( 1. 25u /μL) 1μL，3’ＲACE YZF1 ( 20μM) 1μL，3’ＲACE YZＲ1 Primer( 20μM) 1μL，加無(wú)菌水至總 體 積21μL。PCＲ 反 應(yīng) 程 序 為: 94℃1 min，( 98℃10S，55℃15 S，68℃l min) 35個(gè)循環(huán)。將所得PCＲ 產(chǎn)物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，將引物3’ＲACE YZF1改成3’ＲACE YZF2，其余反應(yīng)產(chǎn)物及反應(yīng)條件均不變。所得PCＲ 產(chǎn)物純化，克隆擴(kuò)增及測(cè)序。

2結(jié)果

2. 1

犬小孢子菌總ＲNA用紫外分光光度計(jì)測(cè)得的OD260與OD280的比值，約為1. 6，表明 ＲNA的純度較好。ＲNA電泳結(jié)果28 S與18 S條帶的亮度比值為2∶1，5 S的亮度較弱(圖1 )，表明所提取的總 ＲNA完整，降解少。

2.2

3'ＲACE和5'ＲACE擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè) 根據(jù)測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì) ＲACE反應(yīng)的特異引物，對(duì)獲得的3'ＲACE和5'ＲACE序列進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果如圖2和3所示，FSH1基因的3’ＲACE和5’ＲACEPCＲ 序列長(zhǎng)度分別約為730bp和450bp。

2. 3

FSH1基因3'ＲACE和5'ＲACE擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序與全長(zhǎng)序列驗(yàn)證3'ＲACE和5'ＲACE擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純化、克隆、測(cè)序，得到3'ＲACE和 5'ＲACE序列長(zhǎng)如圖4所示，總長(zhǎng)度為約820bp，可以證明5'ＲACE和3'ＲACE產(chǎn)物來(lái)源于一條mＲNA鏈且包含CDS大多數(shù)序列。

2. 4

FSH1基因全長(zhǎng)c DNA序列分析 對(duì) 獲得 的FSH1基因序列分析發(fā)現(xiàn)，該基因核苷酸序列全長(zhǎng)為945bp，開放閱讀框( OＲF)長(zhǎng)度為831bp，編碼276個(gè)氨基酸，包含44bp的5' UTＲ，70bp的3' UTＲ。通過(guò)BLAST同源性分析，得出與犬小孢子菌的結(jié)構(gòu)域蛋白同源性達(dá)100%，與石膏樣小孢子菌結(jié)構(gòu)域蛋白同源性達(dá)78%。

3討論

FSH1基因是犬小孢子菌中一個(gè)新的基因。其編碼絲氨酸水解酶，包含一個(gè)Ser/His/Asp活性位點(diǎn)，屬于多功能 αβ 水解酶超家族。Simon等通過(guò)活性位點(diǎn)和其它蛋白結(jié)構(gòu)的分析，表明FSH1是一個(gè)酯酶、肽酶、酰胺酶等，能夠水解疏水磷酸酯、油酯化合物。Baxter等通過(guò)計(jì)算機(jī)合成及蛋白組學(xué)的方法分析了FSH家族，得出其家族龐大，功能較多，在啤酒酵母菌和其它有核生物中分離出的FSH家族基因有46種，在啤酒酵母菌中就有15種。在啤酒酵母基因文庫(kù)中不同的絲氨酸水解酶有不同的功能:包括蛋白酶作用，可以分解蛋白，使其變?yōu)閱蝹€(gè)氨基酸和寡肽;在內(nèi)源性信號(hào)因子的新陳代謝中的酰胺酶作用，調(diào)控新陳代謝;在藥物代謝中的羧酸酯酶作用等。在前期頭癬發(fā)病機(jī)制的研究中得出一個(gè)可能的致病因子即FSH1基因編碼的蛋白酶，鑒于FSH1蛋白酶功能如此強(qiáng)大，故進(jìn)一步研究FSH1基因的功能及其在頭癬中的發(fā)病機(jī)制可行性較大。

本實(shí)驗(yàn)采用ＲACE技術(shù)成功對(duì)FSH1基因片段5'端擴(kuò)增出一條196bp大小基因，3'端擴(kuò)增出一條496bp大小基因，并根據(jù)3'ＲACE產(chǎn)物擴(kuò)增全長(zhǎng)得到目的片段945bp，其開放閱讀框長(zhǎng)度為831bp，編碼276個(gè)氨基酸，序列分析表明其5'端非編碼區(qū)大小為44bp，3'端非編碼區(qū)大小為70bp。通過(guò)BLAST同源性分析，得出與犬小孢子菌的結(jié)構(gòu)域蛋白同源性達(dá)100%，與石膏樣小孢子菌的結(jié)構(gòu)域蛋白同源性達(dá)78%。經(jīng)查閱文獻(xiàn)尚未見到有關(guān)真菌結(jié)構(gòu)域蛋白的相關(guān)報(bào)道。

隨著分子生物學(xué)的進(jìn)步，目前對(duì)于新基因的研究方法較多。例如基因沉默、基因敲除技術(shù)越來(lái)越多地被成功應(yīng)用于皮膚癬菌的未知致病因子研究。Shi等發(fā)現(xiàn)Sub6可能是須癬毛癬菌的致病因子，即利用基因干擾技術(shù)對(duì)Sub6進(jìn)行功能研究，得出Sub6基因干擾后菌株的致病性減弱，引起超敏反應(yīng)的細(xì)胞因子水平降低。因此本研究通過(guò)擴(kuò)增FSH1新基因的全長(zhǎng)，為將來(lái)深入研究犬小孢子菌FSH1基因的功能及其在頭癬發(fā)病中的機(jī)理奠定了基礎(chǔ)，為將來(lái)新藥靶位研究提供了相關(guān)的理論根據(jù)。

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