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文章轉(zhuǎn)載自：中國醫(yī)學文摘·皮膚科學2017年第1期

作者：劉志超，劉原君，江勇，劉全忠

生殖道沙眼衣原體感染( genital chlamydial infec-tions，GCI)可引起多種器官的慢性炎癥，甚至導致不孕不育。其臨床表現(xiàn)復雜，遷延難愈，10%～15%的患者在治療期間出現(xiàn)再感染和持續(xù)感染，但不是所有感染衣原體的患者都會出現(xiàn)持續(xù)感染。研究發(fā)現(xiàn)抗生素誘導、營養(yǎng)缺乏、細胞因子等都可在體外模型中誘導衣原體進入持續(xù)性感染狀態(tài)，其中營養(yǎng)缺乏的條件包括色氨酸缺乏和缺鐵等。為了進一步探討衣原體持續(xù)感染形成的機制，本課題組在既往研究的基礎(chǔ)上，觀察色氨酸缺乏及外源性吲哚對沙眼衣原體生長的影響，以期發(fā)現(xiàn)沙眼衣原體持續(xù)感染的可能機制，為臨床診療提供幫助。

1材料及方法

1. 1材料

沙眼衣原體E-UW-5 / Cx型、D-UW-5 / Cx標準株由美國馬里蘭大學衣原體研究中心提供，臨床株由天津醫(yī)科大學性傳播疾病研究所提供并保存。Hela細胞(人宮頸癌細胞起源)購自中國醫(yī)學科學院皮膚病研究所，并由天津市性傳播疾病研究所細胞培養(yǎng)室保 存。DMEM-10細 胞 培 養(yǎng) 液 配 制: DMEM粉9. 6g，Na HCO32g，加蒸餾水至1000m L，用直徑為0. 2μm的濾器抽濾DMEM液，分裝至無菌瓶中，并用封口膜密封。缺乏色氨酸的DMEM-10細胞培養(yǎng)液［簡 稱: DMEM-10 ( -Trp)］配制: Dulbecco's MEM( DMEM) F-12 w /o Tryptophan粉12. 048g，丙酮酸鈉0. 110 04g，HEPES 2. 603g，加蒸餾水至1 000m L，用Na HCO3或HCL調(diào)PH值至7. 2。吲哚0. 023 43g溶于200m L甲醇中，形成10 000μM indole;按倍數(shù)稀釋，形成10μM indole和50μM indole。

1. 2實驗方法

用DMEM-10 ( -Trp)培養(yǎng)Hela細胞48h，使細胞處于色氨酸缺乏狀態(tài)。將生長狀態(tài)良好的Hela細胞傳至6孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24h，以形成致密單層，再分別接種感染率為0. 1 MOI的沙眼衣原體E型、D型標準株及其臨床株; 32℃，3 000r/min離心1h，靜置5% CO2的37℃ 孵箱2 h，棄去培養(yǎng)板中的離心液，分別用DMEM-10細胞培養(yǎng)液(簡稱: DMEM-10)、DMEM-10( -Trp)和DMEM-10( -Trp)中加入10μM外源性吲哚的細胞培養(yǎng)液［簡稱: DMEM-10( -Trp) + IND］繼續(xù)培養(yǎng)48h。

1. 3包涵體計數(shù)方法

細胞分別培養(yǎng)48h后，棄去培養(yǎng)板中液體，風干后甲醇固定15min，用盧戈氏碘液染色，計數(shù)不同培養(yǎng)液作用下的包涵體數(shù)目，每孔計數(shù)30個視野(×400倍鏡下)取均值。臨床株采用相同的計數(shù)方法。

1. 4統(tǒng)計學方法

用SPSS 18.0軟件，各組數(shù)值間比較采用q檢驗，P＜0. 05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2. 1三種不同培養(yǎng)液作用下沙眼衣原體

E-UW-5/Cx臨床株的包涵體數(shù)目及細胞形態(tài)與正常對照組細胞相比，DMEM-10組及DMEM-10( -Trp) + IND組的細胞形態(tài) 正常，生 長狀 態(tài) 良 好。DMEM-10組( 1a)和DMEM-10( -Trp) + IND組( 1b)的包涵體數(shù)目明顯多于DMEM-10( -Trp)組( 1c)。

2. 2外源性吲哚及色氨酸缺乏對E型標準株及臨床株包涵體數(shù)目的影響

見表1。分別應(yīng)用三種細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)E型標準株和臨床株后，發(fā)現(xiàn)DMEM-10 ( -Trp)組衣原體包涵體計數(shù)明顯低于DMEM-10組( q =65. 23)和DMEM-10( -Trp) + IND組( q = 67. 44)，差異均有統(tǒng)計學意義( P＜0. 05) ;但是DMEM-10組和DMEM-10( -Trp) + IND組包涵體計數(shù)差異無統(tǒng)計學意義( q = 2. 21，P＞0. 05)。

2. 3外源性吲哚及色氨酸缺乏對D型標準株及臨床株包涵體數(shù)目的影響

見表2。DMEM-10( -Trp)組衣原體包涵體計數(shù)明顯低于DMEM-10組( q = 53. 74)和DMEM-10( -Trp) + IND組( q = 55. 42)，差異有統(tǒng)計學意義( P均 ＜0.05) ; DMEM-10和DMEM-10( -Trp) +IND組包涵體計數(shù)差異均無統(tǒng)計學意義( q = 1.68，P＞0.05) ; E型標準株，臨床株與D型標準株和臨床株間包涵體計數(shù)差異也均無統(tǒng)計學意義( P＞0. 05)。

3討論

沙眼衣原體是人類性傳播疾病的主要病原體之一，為色氨酸營養(yǎng)缺陷體，須從宿主獲得這種必須氨基酸以維系其生長繁殖。本研究發(fā)現(xiàn)，在色氨酸缺乏條件下，沙眼衣原體的生長繁殖受到明顯抑制，即DMEM-10 ( -Trp )組 衣 原 體 包 涵 體 計 數(shù) 明 顯 低 于DMEM-10組，差異有統(tǒng)計學意義;而在加入外源性吲哚后，DMEM-10( -Trp) + IND組包涵體計數(shù)與DMEM-10組則無明顯差別，其可能原因是泌尿生殖道沙眼衣原體D型和E型菌株的色氨酸合成酶基因可以編碼一種有功能的色氨酸合成酶，該酶可以利用吲哚作為底物來合成色氨酸。

Caldwell等的研究認為在低濃度吲哚存在時，沙眼衣原體可以逃逸IFN-γ 介導的清除作用并產(chǎn)生有感染性的沙眼衣原體，維持其致病能力。這種機制可能允許某些株系逃逸IFN-γ 介導的清除作用，從而建立持續(xù)性感染。有研究顯示，在女性尿道中存在多種可以產(chǎn)生吲哚的微生物，包括梭菌屬、消化鏈球菌屬、革蘭陰性需氧菌(大腸桿菌)等，而男性尿道中吲哚產(chǎn)生相對較少，沙眼衣原體生殖器菌株可以使陰道菌群分泌的吲哚轉(zhuǎn)變成色氨酸，從而使衣原體逃脫IFN-γ 的殺傷作用，并形成持續(xù)感染。

本研究結(jié)果顯示應(yīng)用缺乏色氨酸的細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)泌尿生殖道沙眼衣原體國內(nèi)優(yōu)勢株E型標準株和臨床株，其包涵體數(shù)目比正常組明顯減少;在加入外源性吲哚后，衣原體生長又有明顯的恢復，包涵體數(shù)目與正常組無明顯差別。說明在色氨酸缺乏時，沙眼衣原體轉(zhuǎn)化為無感染性的網(wǎng)狀體，在宿主細胞內(nèi)持續(xù)存在;在加入外源性吲哚(宿主的色氨酸庫恢復正常)后，泌尿生殖道沙眼衣原體可以利用吲哚作為底物來合成色氨酸，快速的從網(wǎng)狀體轉(zhuǎn)變?yōu)橛懈腥拘缘脑w進行分裂繁殖。這與Caldwell等研究D，I和L2型衣原體的結(jié)果相一致。色氨酸缺乏可能是發(fā)生Ct持續(xù)感染的重要原因。但持續(xù)感染究竟機制如何，還有待進一步研究。

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